顯微課程 | 激光顯微切割的耗材
更新時(shí)間：2024-09-29 點(diǎn)擊次數(shù)：209
不同應(yīng)用的正確解決方案
激光顯微解割（LMD）系統(tǒng)有許多不同類(lèi)型的耗材。它們涵蓋了從基礎(chǔ)到高度專(zhuān)業(yè)化的廣泛應(yīng)用，使科學(xué)家能夠根據(jù)自己的研究領(lǐng)域選擇個(gè)性化的配置。
最常見(jiàn)的耗材是各種玻璃膜載玻片，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)蓋子以收集解剖樣本。還使用框架載玻片、帶和不帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿、Ibidi 載玻片和多室培養(yǎng)載玻片。此外，徠卡 LMD 系統(tǒng)的靈活軟件設(shè)置允許使用自制或定制的標(biāo)本載體或激光微切割的收集裝置。
一般來(lái)說(shuō)，徠卡顯微系統(tǒng)提供演示載玻片套件，其中包含不同類(lèi)型的載玻片，以測(cè)試不同應(yīng)用的不同可用膜，以找到zuishihe任何應(yīng)用的膜載玻片。特別是對(duì)于熒光，測(cè)試不同的載玻片可以讓你的生活更輕松。例如，PPS 相比于 PEN 具有更少的自發(fā)熒光，但 POL 或 PET 也可能適合你的熒光染料。
眼見(jiàn)為實(shí)，用于嘗試、觀(guān)察并相信！
用于激光顯微切割的特殊膜安裝在玻璃載玻片上，以實(shí)現(xiàn)最高質(zhì)量的結(jié)果。覆蓋有高UV吸收膜的玻璃載玻片，特別適合冷光照射（蒸發(fā)），稱(chēng)為玻璃膜載玻片。此類(lèi)型的載玻片在圖 1a 的左側(cè)顯示。
膜應(yīng)用于玻璃載玻片的上表面，膜的邊緣與玻璃粘合。因此，創(chuàng)建了一個(gè)矩形區(qū)域用于安裝標(biāo)本，其中膜與玻璃基底之間有空氣。膜經(jīng)過(guò)特殊涂層處理，以確保標(biāo)本的最佳粘附。
一般來(lái)說(shuō)，玻璃膜載玻片在膜輔助激光顯微切割（LMD）中具有多種應(yīng)用潛力，并配有不同應(yīng)用的各種涂層。
小心處理薄膜對(duì)于避免膜損壞至關(guān)重要。應(yīng)避免玻璃與膜之間的水分積聚，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致切割物粘附在玻璃基底上。玻璃載玻片有兩種不同的膜類(lèi)型：
圖 1a - 1c 分別展示了用于電機(jī)臺(tái)、掃描臺(tái)或 ITK LMT350 超臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)樣品架，放置了不同的載玻片。圖 1 顯示了一個(gè)玻璃載玻片（左）、一個(gè)框架載玻片（中）和一個(gè) Ibidi®載玻片（右）。
圖 1c：LMT350 超階段的標(biāo)本架
（載玻片尺寸：26 x 76 mm，LMD可用區(qū)域 19 x 41 mm）
標(biāo)準(zhǔn)載玻片具有 PEN 膜。這些膜可以用于大多數(shù)LMD應(yīng)用，除了在植物研究中使用的jigao激光能量。例如，PEN 膜有兩種不同的厚度：2.0 µm 或 4 µm。4 µm 是一種特殊的發(fā)明，旨在與徠卡 LMD系統(tǒng)結(jié)合使用：該膜比 2 µm 標(biāo)準(zhǔn)膜更強(qiáng)，便于切片安裝，并在安裝過(guò)程中降低膜受損的風(fēng)險(xiǎn)，且膜本身更重，因此更容易通過(guò)重力收集。
PEN 膜片也有經(jīng)過(guò)認(rèn)證的 RNase 和 DNase 自由版本，以保證在 DNA 和 RNA 研究中無(wú)污染的工作。與 PEN 膜片一樣，PPS 涂層膜片也可以在幾乎所有激光輔助顯微切割技術(shù)中使用。PPS 膜片的自發(fā)熒光較少，表面結(jié)構(gòu)比 PEN 膜片更光滑，但在化學(xué)處理（例如，二甲苯）方面的耐受性不如 PEN 膜片。當(dāng)使用玻璃片時(shí)，重要的是將其放入標(biāo)本架中，組織面朝下。否則，所需區(qū)域?qū)⒈磺懈睿珪?huì)掉落在膜和捕獲裝置之間的玻璃底座上，而不是被捕獲在收集容器中。
（載玻片尺寸：52 x 76 mm，LMD 可用區(qū)域 39 x 45 mm）
這些是用于特別大標(biāo)本的 PEN 或 PPS 膜玻璃載玻片，例如在神經(jīng)科學(xué)中使用的組織切片?？商峁┨厥獾臉?biāo)本夾用于顯微解剖。大玻璃載玻片可見(jiàn)于圖 2a 和 2b。
圖 2a 和 2b：該標(biāo)本夾可用于大型 PEN 或 PPS 載玻片以及培養(yǎng)皿（參見(jiàn)圖 10a）。
（載玻片尺寸：26 x 76 mm，LMD可用區(qū)域 16 x 45 mm）
框架載玻片由金屬框架組成，可以覆蓋各種膜（圖 4b）。此類(lèi)型載玻片可用的膜如下：
結(jié)合特殊的 150 倍干式物鏡（圖 3），它在不需要浸油的情況下提供亞細(xì)胞分辨率，框架載玻片非常適合單細(xì)胞和染色體應(yīng)用。當(dāng)使用框架載玻片時(shí)，解剖樣本直接粘附在箔片上，因此特別適合于極小樣本的解剖，例如染色體解剖?？蚣苤尉哂型蛊鸬谋砻娼Y(jié)構(gòu)，恰好適合框架載玻片前部的凹 cavity，便于將組織切片固定到膜上。這創(chuàng)造了一個(gè)平坦的表面并支撐膜?？蚣苤卧谀撤N程度上形成了膜的骨架，為在樣本準(zhǔn)備過(guò)程中將樣本施加到膜上提供了足夠的阻力和張力（圖 4）
圖 3：150 倍干式物鏡，專(zhuān)為與 POL 膜載玻片結(jié)合而設(shè)計(jì)，用于解剖每一個(gè)微小樣本。
然而，框架滑片可以在沒(méi)有框架支撐的情況下用于安裝組織切片。
像適當(dāng)涂層的玻璃膜滑片一樣，帶有 PPS 膜的框架滑片幾乎可以用于任何應(yīng)用。
而帶有 POL 膜的框架滑片主要用于染色體解剖（Post 等，MolEcoNotes，2006），結(jié)合 150 倍干物鏡，帶有 PET 膜的框架滑片則非常適合后續(xù)的質(zhì)譜分析技術(shù)（Drummond 等，Acta Neuropathol 2017）。與其他可用膜相比，PET 幾乎不含增塑劑，這些增塑劑可以通過(guò) HPLC 與蛋白質(zhì)分離。這些增塑劑可能會(huì)阻塞部分質(zhì)譜圖譜，使得某些頻帶無(wú)法在被阻塞的頻譜區(qū)域中觀(guān)察到。類(lèi)似的現(xiàn)象也可以在用于收集的 PCR 管中觀(guān)察到。
特殊的 FLUO 膜特別適合熒光、PH 和真正的DIC。
框架載玻片也可以用作活細(xì)胞培養(yǎng)的樣本載體。因此，載玻片的矩形腔體被用作培養(yǎng)皿。建議在這種培養(yǎng)中，將載玻片放入更大的培養(yǎng)皿中，并在將細(xì)胞接種到腔體膜上后wanquan覆蓋培養(yǎng)基。如果使用 PEN 膜，培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不會(huì)改變，而其他類(lèi)型的膜可能會(huì)由于不同膜的表面特性導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不同。
可以為難以附著在膜上的樣本創(chuàng)建兩個(gè)框架滑片的夾層：簡(jiǎn)單地將樣本夾在兩個(gè)框架的膜之間，激光足夠強(qiáng)大，可以切割這樣的夾層堆疊。液滴或涂抹制備也可以輕松應(yīng)用于使用框架滑片的激光顯微切割。
對(duì)于植物應(yīng)用以及其他硬組織如骨頭、牙齒等，推薦使用框架滑片，因?yàn)樗鼈儽炔ＡЩ?strong>兼容高激光功率。高激光功率可能會(huì)邊緣玻璃，使得附著在其上的材料更難切割。
對(duì)于植物樣本如葉子，根本不需要膜載玻片作為載體，因?yàn)檫@種材料可以直接應(yīng)用于激光微切割（H?lscher，Rec Adv Polyphenol Res（2019））。
在LMD解剖后，樣本在重力作用下掉入收集容器，例如標(biāo)準(zhǔn)的薄壁微離心管及其蓋子。不同滑片與蓋子的組合是激光顯微解剖中最常見(jiàn)的應(yīng)用之一。通常使用標(biāo)準(zhǔn)的 0.2 毫升和 0.5 毫升管，蓋子可以是空的（干燥的）或裝有合適的緩沖液或類(lèi)似的適宜介質(zhì)。例如，蓋子中含有 RNase 抑制劑的溶液可以防止核酸在激光顯微解剖過(guò)程后立即分解。同樣，蛋白質(zhì)也可以通過(guò)緩沖液保持在穩(wěn)定狀態(tài)?？盏摹⒏稍锏纳w子提供了一種良好的識(shí)別解剖樣本的方法，并且可以通過(guò)拍攝前后照片進(jìn)行輕松比較?；旧希⒔馄蕵颖究梢赞D(zhuǎn)移到任何標(biāo)準(zhǔn)蓋子上。圖 5a 和 5b 顯示了蓋子和微離心管的匹配收集器。盡管可以使用特殊的 OptiCaps（#11505169），但對(duì)于徠卡激光顯微解剖來(lái)說(shuō)，這些并不是必需的。OptiCaps 具有集成的光學(xué)元件，以確保最佳的照明均勻性，并且可能是“粘性"的。然而，Leica LMD 系統(tǒng)不需要使用昂貴的非標(biāo)準(zhǔn)管蓋，因?yàn)槭占^(guò)程是重力驅(qū)動(dòng)的，不需要克服重力。
此外，還有 1.5 毫升的管子，配有硅膠填充的蓋子。在 LMT350 超階段的多收集器中，借助杠桿，這個(gè)填充的蓋子可以與膜上的組織接觸。這個(gè)設(shè)置有助于收集具有挑戰(zhàn)性的粘性樣本。
還有可能收集到特殊的樣本設(shè)備中，例如用于組織均質(zhì)化、蛋白質(zhì)提取和通過(guò)壓力循環(huán)技術(shù)消化的 PCT 微管（PCT, PressureBioSciences Inc.）。直接收集到這些設(shè)備中可以節(jié)省時(shí)間，因?yàn)椴恍枰匦乱埔骸?/p>
圖 5：用于收集蓋子和微量離心管的特殊收集裝置可以用于正常尺寸的 0.2 毫升（a）和 0.5 毫升（b）。收集器直接位于樣本下方，解剖物因重力作用直接落入管蓋中。
適用于 8 孔條、8 孔和 12 孔條蓋以及多孔載玻片（如 18 孔 Ibidi 載玻片或 LOC（實(shí)驗(yàn)室芯片）載玻片的通用支架。
適用于不同收集設(shè)備的通用支架在同一載體中dute于徠卡，并提供多種不同收集設(shè)備的選項(xiàng)，適用于不同的應(yīng)用。此外，通用支架可調(diào)節(jié)高度，以將所選收集器調(diào)整至靠近標(biāo)本載體，以實(shí)現(xiàn)最小的落距。
8 孔條可用于大容量應(yīng)用（例如，將活細(xì)胞收集到培養(yǎng)基中），8 孔條蓋非常適合高通量應(yīng)用。此外，通用支架適合攜帶室內(nèi)載玻片、多孔載玻片以及 LOC（實(shí)驗(yàn)室芯片）設(shè)備，如 Ibidi®載玻片。所有設(shè)備均可用作激光顯微切割的收集設(shè)備。
這些收集器的開(kāi)發(fā)旨在提高對(duì)解剖活細(xì)胞后續(xù)檢查的樣本通量，并可以組合在一起形成 96 孔板。圖 6a 和 6b 各顯示了一個(gè)適合的持有器，帶有 8 孔條 LCC，可以組合形成孔板?？装迨沁M(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)高通量篩選的基礎(chǔ)。
使用這樣的篩選技術(shù)，可以在極短的時(shí)間內(nèi)分析大量單細(xì)胞培養(yǎng)，并在必要時(shí)進(jìn)行再培養(yǎng)。
圖 6a 和 6b：8 孔條作為解剖收集器，使細(xì)胞培養(yǎng)的高通量篩選成為可能。
8 孔和 12 孔條蓋（用于分子生物學(xué)/PCR）
0.2 毫升 8 孔條的蓋子可以用作激光顯微切割的收集器。在激光顯微切割后，8 孔條的蓋子可以放在 0.2 毫升 8 孔條或 96 孔 PCR 板上，直接插入 PCR 機(jī)器（可根據(jù)要求提供）。使用 8 孔條在后續(xù) PCR、定量 PCR 或其他加熱或冷卻過(guò)程中，特別適合處理大量樣本。
可調(diào)高度的 48 孔收集器（圖 8）允許同時(shí)使用六個(gè) 8 孔條，這樣在一次實(shí)驗(yàn)中以最小的努力就可以輕松填充 96 孔板。
通用支架也適用于其他 LOC 設(shè)備，例如 18 孔 Ibidi®載玻片和用于活細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用的腔室載玻片（圖 9）。任何自制的收集裝置，只要具有載玻片的 x-y 尺寸，也可以與此支架結(jié)合使用。
有多種與激光解剖、操作和選擇技術(shù)兼容的標(biāo)本載體，適用于 LCC（活細(xì)胞培養(yǎng)）。徠卡提供特定于LMD的耗材用于活細(xì)胞處理：
這些帶有 PEN 膜的耗材可以作為解剖的標(biāo)本載體，或者，即使沒(méi)有 PEN 膜，也可以作為活細(xì)胞激光操作的標(biāo)本載體，或者作為再培養(yǎng)、克隆或下游分析的收集容器。
框滑片的矩形腔體也可以用于細(xì)胞培養(yǎng)（見(jiàn)上文 → 框滑片）。
此外，帶有 PEN 膜的培養(yǎng)皿以及 Ibidi® 滑片可以與常用的收集器（0.5 毫升管、0.2 毫升管、8 孔條、8 條管蓋、Ibidi 滑片、常規(guī)培養(yǎng)皿、多室培養(yǎng)滑片和 96 孔板）結(jié)合使用。
圖 10a：一個(gè)培養(yǎng)皿和一個(gè)帶有 PEN 膜的 18 孔 ibidi 載玻片，用于活細(xì)胞培養(yǎng)。
培養(yǎng)皿通常適合活細(xì)胞培養(yǎng)（LCC），并且有帶或不帶 PEN 膜的版本。圖 10b 顯示了已經(jīng)在圖 2a 和 2b 中說(shuō)明的大型 PEN/PPS 載玻片和培養(yǎng)皿的樣品架；一個(gè)帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿已被插入，代替了大型載玻片。圖 10c 顯示了將培養(yǎng)皿用作收集器的情況。
（? 50 毫米）
不帶 PEN 膜的傳統(tǒng)培養(yǎng)皿用于收集和再培養(yǎng)解剖物。不帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿不能在激光顯微解剖的樣品架中使用，但可以用于活細(xì)胞操作實(shí)驗(yàn)。然而，選定區(qū)域可以使用LMD激光進(jìn)行操作，并通過(guò)延時(shí)電影功能觀(guān)察長(zhǎng)時(shí)間。
(? 50 mm，適用于LMD的可用區(qū)域 ? 30 mm)
在帶有 PEN 膜的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞可以在 LCC 模式下進(jìn)行解剖，并轉(zhuǎn)移到其他培養(yǎng)皿（帶或不帶 PEN 膜）或其他合適的收集容器中。膜可以涂覆聚-L-賴(lài)氨酸或膠原蛋白，以提高粘附性和細(xì)胞生長(zhǎng)。
（載玻片尺寸：26 x 76 mm，每個(gè)孔適用 30 µl 液體 ）
這些載玻片配備了專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于激光顯微解剖活細(xì)胞的孔。每個(gè)載玻片有 18 個(gè)凹槽，底部為 PEN 膜。
Ibidi® 幻燈片可以與適用于 LCC 模式的所有收集器組合使用。
圖 11a：用于 ibidi 幻燈片的 LMT350 超級(jí)臺(tái)的幻燈片支架。
另一種無(wú)污染的選擇變體是所謂的幻燈片堆疊（圖 11b、11c），由兩個(gè) Ibidi 幻燈片以三明治技術(shù)疊放而成。從這樣的堆疊中解剖的細(xì)胞會(huì)因重力直接落入下方固定在特殊堆疊支架中的 Ibidi 幻燈片中（圖 11b、11c）。后續(xù)的再培養(yǎng)以及提取細(xì)胞的下游分析都是可能的。
匹配的蓋子提供了進(jìn)一步的污染保護(hù)選項(xiàng)。
Ibidi® 幻燈片也可以與通用支架結(jié)合使用，作為 LOC 設(shè)備的收集裝置（圖 11c）。
對(duì)于需要更高通量的實(shí)驗(yàn)，還有一種解決方案。96 孔標(biāo)準(zhǔn) PCR 板（半裙邊、無(wú)裙邊或全裙邊）使用戶(hù)能夠并行收集多達(dá) 96 個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的材料。這些板可以直接放入標(biāo)準(zhǔn) PCR 機(jī)器中。此外，還有用于活細(xì)胞的 96 孔板支架，例如用于克隆目的。
還有一個(gè)收集器選項(xiàng)，可以直接解剖到由公司Covaris®制造的特殊 96 孔板中，以進(jìn)行超聲處理。
圖 12a：與 LMT350 超級(jí)平臺(tái)一起使用的無(wú)裙邊 96 孔板作為收集器。圖 12b、12c 和 12d：無(wú)裙邊、半裙邊和活細(xì)胞 96 孔板的收集支架。
表 1：激光顯微解剖用膜滑片和培養(yǎng)皿 – 根據(jù)膜類(lèi)型、膜支撐和使用的物鏡比較切割性能。激光顯微解剖性能：– 不適合；+ 滿(mǎn)意；++ 良好；+++ 非常好。a這些物鏡在與最佳圖像質(zhì)量結(jié)合時(shí)，具有改進(jìn)的光學(xué)性能以傳輸 UV 光。D 代表校正環(huán)的位置。
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