【案例分享】利用激光顯微切割（LMD）在空間背景下分離神經(jīng)元

帕金森癥（PD）是一種神經(jīng)退行性疾病，會(huì)降低受影響個(gè)體的生活質(zhì)量。著名運(yùn)動(dòng)員muhanmodei·阿里和演員邁克爾·J·?？怂咕褪腔加谢蛟?jīng)患有帕金森癥的著名例子。該病的成因多種多樣，例如遺傳（邁克爾·J·?？怂沟那闆r）或物理影響（muhanmodei·阿里的情況）。到目前為止，治療該病主要側(cè)重于癥狀的緩解，主要通過(guò)服用 L-DOPA（多巴胺前體）藥物來(lái)實(shí)現(xiàn)。

該病的根本原因是中腦或黑質(zhì)（SN，黑色物質(zhì)）中一群多巴胺能（DA）神經(jīng)元的選擇性死亡^[1,2]。在超過(guò)60%的多巴胺能神經(jīng)元損失后，才可見(jiàn)到第一個(gè)表型。因此，基于年齡和性別匹配的對(duì)照，對(duì)死后帕金森病患者的中腦組織進(jìn)行比較，就像是拿蘋果和香蕉進(jìn)行比較。因此，必須逐一分析黑質(zhì)致密部中幸存的多巴胺能神經(jīng)元，以發(fā)現(xiàn)這些特定多巴胺產(chǎn)生細(xì)胞之間的差異。

關(guān)于該病的起源有多種理論。因此，帕金森病可以比作一個(gè)拼圖。已經(jīng)找到了許多碎片，并且已經(jīng)組合了一些碎片，但仍然沒(méi)有人知道整個(gè)畫面是什么樣子。一些碎片的重要性尚未確定，也沒(méi)有人知道在能夠清楚地了解帕金森病之前，還需要找到多少碎片才能呈現(xiàn)完整的畫面。

由于帕金森病通常在較晚的年齡出現(xiàn)，因此用于研究帕金森病的動(dòng)物模型相當(dāng)罕見(jiàn)，因此，嚙齒類（小鼠和大鼠）模型沒(méi)有與人類相似的明確表型。在猴子中進(jìn)行的研究，其中帕金森病可以通過(guò)藥物引入，即使在較年輕的動(dòng)物中，也是昂貴的，并且需要許多研究人員無(wú)法獲得的特殊條件。除了這些挑戰(zhàn)之外，單個(gè)神經(jīng)元的活性通常通過(guò)電生理學(xué)來(lái)研究。這種方法需要活腦組織切片，而這是無(wú)法從人身上獲取的。因此，需要一種不同的方法來(lái)選擇性分析多巴胺能（DA）神經(jīng)元。出于這個(gè)原因，激光顯微切割（LMD）方法發(fā)揮了作用^[3]。

通過(guò)將使用針進(jìn)行修補(bǔ)以提取內(nèi)容進(jìn)行下游分析的單個(gè)神經(jīng)元的分子生物學(xué)結(jié)果，與激光顯微切割（LMD）解剖的神經(jīng)元的結(jié)果進(jìn)行比較，可以證明這兩種收集方法的結(jié)果是可比的。此外，LMD允許研究人員從死后人類中腦收集單個(gè)神經(jīng)元，更具體地說(shuō)，是從黑質(zhì)（SN）中收集，因?yàn)镈A神經(jīng)元由于含有神經(jīng)黑色素而呈黑色，因此很容易識(shí)別。使用LMD，可以分析來(lái)自死后帕金森病患者的單個(gè)存活DA神經(jīng)元和匹配對(duì)照組的表達(dá)模式，目的是找到兩組在分子水平上的差異。這種調(diào)查有助于理解帕金森病的病因或后果。

分析不同的死后標(biāo)本就像是在帕金森病特定階段的“快照"。這些“快照"可以相互比較，但這些標(biāo)本不能用于檢測(cè)改變的基因表達(dá)是疾病的結(jié)果還是原因。需要進(jìn)一步研究這個(gè)問(wèn)題。此外，考慮到帕金森病患者的基因表達(dá)僅在釋放多巴胺的神經(jīng)元中發(fā)生改變，那么對(duì)于帕金森病謎題的研究，只應(yīng)分析這些相關(guān)的細(xì)胞類型。如果不小心將其他細(xì)胞類型添加到分析物中，它們會(huì)降低結(jié)果的質(zhì)量。

激光顯微切割（LMD），也稱為激光捕獲顯微切割（LCM），是一種用于從各種組織標(biāo)本中在空間背景下隔離特定單個(gè)細(xì)胞或整個(gè)組織區(qū)域的無(wú)接觸、無(wú)污染的方法。原始組織的厚度、質(zhì)地和制備相對(duì)不重要。

然后，可以使用進(jìn)一步的分子生物學(xué)方法對(duì)切割下來(lái)的組織進(jìn)行分析，如下一代測(cè)序（NGS），包括RNA測(cè)序、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）、實(shí)時(shí)qPCR、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和多組學(xué)技術(shù)。LMD現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域，例如病理學(xué)、神經(jīng)學(xué)、癌癥、植物分析、法醫(yī)學(xué)和氣候?qū)W。此外，LMD還用于細(xì)胞培養(yǎng)的操作或蓋玻片的微雕刻。

LMD對(duì)于基因組學(xué)（DNA）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA）和蛋白質(zhì)組學(xué)（蛋白質(zhì)）工作流程的優(yōu)化非常有用，因?yàn)樗试S在視覺(jué)控制下從組織中精確提取和收集純凈的起始材料以供分析。

與完整的組織檢查結(jié)果相比，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的分析經(jīng)常顯示出不同的結(jié)果^[3-6]。研究表明，帕金森病患者的組織中某些microRNA的表達(dá)發(fā)生了變化。

當(dāng)同時(shí)檢查微切割的細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)microRNA的表達(dá)在細(xì)胞水平上并沒(méi)有變化。這種組織偽影是借助激光顯微切割檢測(cè)到的。

使用LMD系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的無(wú)接觸切割，或者在必要時(shí)，實(shí)現(xiàn)更大面積組織的切割。切割下來(lái)的材料被捕獲在試管帽中，可以立即進(jìn)行處理。請(qǐng)參考下面的圖2、圖3和圖4。

目前，沒(méi)有用于早期診斷帕金森病的測(cè)試，而且該疾病存在許多變異。此外，還有一些具有類似癥狀的疾病。因此，一定比例的帕金森病病例被誤診或根本沒(méi)有被診斷出來(lái)。

成功治療帕金森病的前提是有效的早期診斷。如果能夠在神經(jīng)元?jiǎng)倓傞_始退化的初期階段診斷出疾病，就有可能防止神經(jīng)元進(jìn)行性退化并wan全阻止疾病的發(fā)展。

在血液或腦脊液中識(shí)別生物標(biāo)志物是目前研究的主要焦點(diǎn)。有些基因不僅在大腦中表達(dá)，而且在所有細(xì)胞中普遍表達(dá)。如果帕金森病病例中多巴胺能神經(jīng)元的這些基因表達(dá)發(fā)生變化，就可以更容易地檢查可接近的組織以用于診斷目的。

也許在不久的將來(lái)，激光顯微切割（LMD）與人工智能（AI）甚至質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合，可以為更好地理解帕金森病帶來(lái)進(jìn)一步的突破。