光片顯微鏡中的光束選擇

在光片顯微鏡中，主瓣是指光片中強度最高的區(qū)域，它直接影響著顯微鏡的軸向分辨率。主瓣越薄，理論上分辨率越高。然而，光片的光切片，即整個光片的厚度，同樣對成像質量有著決定性的影響。光切片不僅包括主瓣，還包括可能影響對比度的旁瓣或次要結構。

在許多先前的出版物中，未能區(qū)分光片厚度和主瓣厚度可能會導致混淆，例如在提到“通過掃描貝塞爾光束產(chǎn)生的超薄平面照明"或“超薄貝塞爾光片"時，主瓣比相同長度的傳統(tǒng)高斯光片更薄^【19,25】。對于zui常用的具有高斯分布的光片來說，只有一個光片，主瓣厚度和光片厚度的測量值嚴格成比例。但如圖1 所示，這對于具有輔助結構（如側瓣或多條平行光片）的多瓣光束并不適用。

對于多瓣光束，當僅考慮主瓣厚度時，樣品暴露的總照明功率中有相當一部分被忽略。這種額外的曝光會在光片顯微鏡中貢獻到檢測到的熒光信號，從而可能降低圖像對比度。因此，考慮以下幾點非常重要：通常顯示的沿檢測軸的 PSF 切片可以用來推斷軸向分辨率。然而，它們使觀察者無法計光學分層性能或光片厚度。

激光強度是生成光片的基礎。不同強度的激光可以產(chǎn)生不同特性的光片。例如，高強度激光可以生成更薄的主瓣，但也可能增加樣品的光漂白和光毒性。

圖 2. 主峰厚度和光學分層的定義。展示了單峰光束 (a) 和多峰光束 (b) 的強度在 yz 方向上的橫截面。在焦點處 (紫色線) 和距離 y = L 處 (厚度加倍的地方, 藍色線) 的相應剖面顯示在 c-j 中。c, d 和 e, f 分別說明了單峰光束 (c, d) 和多峰光束 (e, f) 的主峰厚度，定義為在焦點處強度高于最大強度 37% 的范圍，分別在焦點處 (c, e) 和距離 y = L 處 (d, f)。子圖 g-j 相應地說明了光學切片厚度 wOS ，定義為包含光束功率 63% 的范圍。

觀察由掃描光束形成的光片時，相關的測量包括：

第一個測量標準提供軸向分辨率，而第二個提供對比度。軸向分辨率是沿檢測 z 軸可以分辨出兩個物體的最小距離。對比度是聚焦特征信號與背景信號（主要來自失焦特征）的差異。圖 2a 顯示了由單峰光束形成的光片的示例。圖 2c 和 2d 顯示了在光束傳播軸上兩個位置處以 1/e=37% 峰值強度測量的分布寬度，圖 2g 和 2h 顯示了標記光束總能量 63% 的積分輪廓。在強度大于峰值強度 37% 的范圍內，高斯強度分布的光片攜帶其總能量的 84%。原因在于光片不是一個圓對稱光束，而是主要沿檢測軸向一個方向擴展。

在比較不同光片時，第一個測量標準（強度下降）與第二個測量標準（區(qū)域內包含的能量）之間的比例與任何長度的單峰光片的比例數(shù)值無關。

對于多峰光片來說，第一個和第二個測量標準得到的值可能會有顯著差異，因為它們表現(xiàn)出更復雜的結構。如圖 2 右側所示，強度分布降到峰值的 1/e 的距離僅反映了主峰的厚度（圖 2e, f）。因此，作者引入了“主峰厚度"這個術語來表示這個測量標準。圖 2i, j 中標示的光學分層 w_OS 考慮到主峰可能不具備足夠的能量來貢獻總檢測信號的 63%。

這一測量標準給出的值明顯大于主峰厚度，更接近反映了光片的真實厚度。

在實際應用中，這些性能參數(shù)之間存在著協(xié)同與權衡。例如，追求更薄的主瓣以提高分辨率可能需要犧牲一些光切片的均勻性，從而影響對比度。同樣，增加激光強度以改善信噪比，也可能帶來光漂白的風險。

圖2. 各種光束類型相對于高斯光束的光學分層（藍色）和主瓣厚度（橙色）的比率。所有值均為光束長度 L 約為 30 µm 計算得出。插圖顯示了解釋圖表的方案。值大于 100% 表示主瓣或光學分層比高斯光束更厚。

對于所有類型的光片顯微鏡，光學切片和軸向分辨率取決于光片的長度。因此，僅在長度相等的情況下比較光片特性是至關重要的。在大多數(shù)情況下，長度是由樣品或研究人員希望在單幀中觀察的視野決定的。

因此，作者選擇首先定義光片長度的方法，然后根據(jù)它們提供的軸向分辨率和光學切片來比較光片。

將高斯光束設為參考值，作者計算了相同光束長度下不同光束類型在厚度和光學切片方面的相對增益或損失。

圖2顯示了長度為30?µm的光片的結果。數(shù)值超過100%表明光片厚度 w_OS 或主瓣寬度w_ML大于高斯光束。

總體而言，作者發(fā)現(xiàn)對于所有光束類型，在這兩個特性之間存在權衡：制造薄光片會以高斯光束的長度或其他光片類型的光學切片為代價。

光片顯微鏡的技術選擇是一個綜合考量的過程，需要在分辨率、對比度、光切片質量和激光強度之間找到最佳的平衡點。通過深入理解這些技術參數(shù)及其相互關系，您可以更加自信地選擇和優(yōu)化適合自己研究的光片顯微鏡技術。

* E. Remacha “Light Sheet Simulator" (2019) [retrieved 5 November 2019]

在Matlab環(huán)境中運行LightSheet_Simulator.mlapp，圖3顯示了GUI示例。有三種可能的操作：

圖3. 光束模擬器用戶界面

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