基于激光顯微切割-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的微量細(xì)胞廣靶脂質(zhì)組學(xué)分析

活細(xì)胞無時不在與外界進(jìn)行著物質(zhì)和能量的交換，其代謝水平應(yīng)是其生命體征的主要表現(xiàn)。在健康和疾病中，代謝程序和它們所支持的特定生理功能之間有著密切的聯(lián)系。這些核心代謝功能的失調(diào)與許多現(xiàn)代疾病有關(guān)。由于每個細(xì)胞都生活在一個du特的環(huán)境中，我們體內(nèi)沒有一個細(xì)胞在新陳代謝、表型和功能上wan全相同。在單細(xì)胞分辨率下，解決代謝的時空異質(zhì)性將推動代謝領(lǐng)域向前發(fā)展，并轉(zhuǎn)換到臨床應(yīng)用和理解體內(nèi)系統(tǒng)代謝組學(xué)變化的基礎(chǔ)。

相比DNA和RNA，細(xì)胞內(nèi)的代謝物無法擴(kuò)增，單個細(xì)胞能夠提供的用于分析的代謝物濃度低體積小，對分析設(shè)備和方法的要求較高。因此，本次研究將具有單細(xì)胞取樣精度的激光顯微切割 (LMD, Laser Microdissection)技術(shù)和SCIEX 7500高靈敏度質(zhì)譜系統(tǒng)聯(lián)合使用，測試在能夠用于有效分析的細(xì)胞數(shù)量。

腦組織做冰凍切片，樣本置于激光顯微切割載物臺；接收端放置PCR管用于分離體的接收。選擇合適的細(xì)胞數(shù)目或切割面積（如~2000μm²），在調(diào)節(jié)好相關(guān)參數(shù)（Power 49、Aperture 5、Speed 13、Bridge size 4）后開始進(jìn)行切割（圖1）。切割完成后，小心將PCR管取出，由管底倒扣至管蓋蓋緊，防止管蓋中收集的樣品遺落。

裝有樣品的PCR管在vortex中振蕩5s，由點(diǎn)甩小型離心機(jī)將微量樣品離心至管底，小心打開管蓋，加入30 μL提取溶液（異丙醇:乙腈:水 30:65:5 v/v/v），振蕩混勻，超聲15 min，離心后將全部溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中待LC-MS/MS分析。LC-MS條件：樣品通過ExionLC^™系統(tǒng)串聯(lián)SCIEX 7500系統(tǒng)，進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)通過SCIEX OS 軟件2.1中的定量功能進(jìn)行處理。

在分離的微量細(xì)胞中（組織切片約2000μm²），共檢測到285個脂質(zhì)化合物，包括鞘脂SM、膽固醇酯CE、甘油三酯TAG、甘油二酯DAG、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰膽堿PC、神經(jīng)酰胺Cer7類。

圖2.微量腦組織切片中測得的不同種類脂質(zhì)化合物的數(shù)量?；贚C-MS/MS 的靶向脂質(zhì)組學(xué)方法快速分析基質(zhì)中的多種脂類物質(zhì)。