用SRS顯微鏡對配方產(chǎn)品進(jìn)行表征分析

受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）可提供具有高空間和時間分辨率的無標(biāo)記化學(xué)信息，因此非常適合用于可視化配方產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)，包括監(jiān)測單一成分在使用期間的所帶來的結(jié)果（包括在使用期間監(jiān)測單一組分的命運(yùn)）。通過選擇適當(dāng)?shù)睦灰?，可以從預(yù)先存在的單個成分的拉曼光譜（圖1左），或從獲取λ掃描生成的SRS光譜（見下文，以及圖3中的示例）進(jìn)行SRS對比，從而對單一成分進(jìn)行成像。

除了這些對比波數(shù)外，還應(yīng)在附近預(yù)期無拉曼強(qiáng)度的波數(shù)處獲取“非共振"控制圖像（見圖2中的示例），從而確保檢測到的信號基于拉曼光譜，并能識別任何雜散信號，如激光吸收產(chǎn)生的偽影。在各成分/相的所需波數(shù)下獲得圖像后，可將圖像合并成一個復(fù)合圖像，從而了解材料中不同成分之間的關(guān)聯(lián)性。除了SRS對比，還可通過使用二次諧波生成或熒光等方法來同時成像，獲得其他結(jié)構(gòu)信息。圖2中的圖像顯示了用SRS顯微鏡成像的防曬霜樣品中油vs水的相位分布，以及用SHG可視化的氧化鋅顆粒。

SRS光譜可通過執(zhí)行λ掃描來生成，在此期間，SRS圖像在泵浦光束的波長上以非常小的增量被捕獲，以生成跨越感興趣波數(shù)范圍的圖像棧。圖3顯示了在含有多種活性成分的皮膚用藥物配方上獲得的這種λ掃描圖像棧。當(dāng)泵浦光束掃過與拉曼光譜的指紋區(qū)相對應(yīng)的波長時，不同的成分依次受到激發(fā)，因?yàn)槠洳〝?shù)受到刺激。獲得這些圖像棧后，可立即選擇相關(guān)特征來生成感興趣區(qū)域（ROI）。從這些ROI中，通過繪制ROI SRS信號強(qiáng)度和泵浦光束波長（可轉(zhuǎn)換為波數(shù)）的關(guān)系，生成SRS光譜。有時，為波長堆棧中所有圖像生成最大投影有助于在一張圖像中實(shí)現(xiàn)所有特征的可視化，確保不會遺漏任何重要特征。

從λ掃描中生成SRS光譜后，可立即將這些光譜與單一成分的自發(fā)拉曼光譜進(jìn)行比較。將光譜信息與圖像中的形態(tài)信息相結(jié)合，對配方的問題分析具有重大價值，如識別是否存在多晶、共晶或氧化產(chǎn)物。

除了分析配方本身的特性外，SRS顯微鏡也可用于對單一成分使用后帶來的最終結(jié)果進(jìn)行可視化。例如，監(jiān)測化學(xué)品在皮膚中的滲透，這在藥物輸送和化學(xué)風(fēng)險評估中具有極其重要的應(yīng)用價值。圖4顯示了4-氰基苯酚給藥后皮膚的圖像。將組織冷凍切片，用SRS成像，以在2235 cm^-1（品紅色）處通過腈基官能團(tuán)的對比來顯示這種化合物的分布。在2850 cm^-1處使用CH2鍵振動模式（紅色）、在1666 cm^-1處采用酰胺I（藍(lán)色）以及使用SHG通道的膠原蛋白分布（綠色），對皮膚結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

由于SRS信號與濃度呈線性關(guān)系，因此有可能通過圖像分析提取某些定量信息，例如，化學(xué)物質(zhì)的相對濃度和皮膚深度。對于在同一共焦平面上成像的物理截面，該操作合理且簡單。然而，當(dāng)對三維標(biāo)本進(jìn)行成像時，必須對激光散射和隨著深度增加產(chǎn)生的吸收所致的信號損失進(jìn)行校正。

試圖對不含dute化學(xué)官能團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行成像時，有時很難獲得特定的對比度。在這種情況下，對感興趣的分子進(jìn)行氘化，可幫助將峰值轉(zhuǎn)移到拉曼光譜的生物“沉默"區(qū)域，該區(qū)域的組織中幾乎無自然存在的信號。這種方法可便于對敏感和化學(xué)特異性成分進(jìn)行可視化，而無需引入會擾亂物理化學(xué)特性，從而擾亂藥代動力學(xué)特征的熒光基團(tuán)。另外，還可采用多變量數(shù)據(jù)分析方法，對不同成分進(jìn)行光譜拆分。