精確三維定位，實現(xiàn)EM成像——掌握精髓

使用簡化的Coral Cryo電子斷層掃描工作流程確保成功

低溫電子斷層掃描（CryoET）是一種成像技術，可以讓研究人員以亞納米分辨率觀察蛋白質(zhì)和其他大生物分子。了解分子的形狀和結構，包括口袋和裂隙，可以幫助研究人員設計能夠像拼圖一樣附著于分子的藥物。低溫ET成像也因此成為了解和治療疾病和失調(diào)的重要基礎。

了解徠卡顯微系統(tǒng)的無縫冷凍電子斷層掃描流程Coral Cryo如何使用共聚焦超分辨率更精確地定位您的意向結構。利用該工作流程，您可以可靠地快速部署實驗，實現(xiàn)更好的可重復性、靈活性，并提高最終結果的準確性。

冷凍電子斷層掃描(CryoET)

使用了冷凍電子斷層掃描（Cryo TEM），將在細胞環(huán)境內(nèi)觀察生物分子的分辨率提升到了1nm，達到了qian suo wei you的精度。通過這種方式，可以僅通過其形狀來識別單個蛋白質(zhì)，而且無需任何標記，甚至可以區(qū)分不同的構象，幫助深入理解分子社會學。

CryoET成像為理解空間蛋白質(zhì)結構和相互作用提供了一種全新的方法，有助于解讀細胞機制并應用這些見解。例如，它們可能有助于開發(fā)多種疾病的治療方法。

但是，亞納米分辨率的成像存在多種挑戰(zhàn)：它的成本高昂，需要大量的培訓，涉及許多儀器操作，而且大多數(shù)情況下，電子顯微鏡（EM）無法選擇性地顯示目標結構。為確保高成功率，在工作流程的光鏡（LM）階段，需要以盡可能高的分辨率識別和定位EM成像的目標體積。

徠卡顯微系統(tǒng)的無縫低溫電子斷層掃描工作流程Coral使用共焦超分辨率進行精確定位。該工作流程不僅減少了樣本制備的步驟，還提高了樣本裝載和轉移的成功率，從而提高了On-Grid Lamella/CryoET工作流程的效率。

目標坐標以開放格式提供給后續(xù)的FIB研磨和LM-EM關聯(lián)。因此，您可以實現(xiàn)更高的工作效率和更好的實驗可再現(xiàn)性。這可以幫助您加速設施中的方案部署，并提高最終結果的準確性。

精確的三維體積定位

STELLARIS 5低溫共聚焦顯微鏡，包括低溫平臺和轉移梭，是Coral Cryo工作流程中精確定位的核心部分。與寬視場儀器相比，共焦顯微鏡的Z分辨率更高，在設計上更適合三維定位。

通過在后續(xù)的高精度關聯(lián)中應用超分辨率的數(shù)據(jù)，STELLARIS 5 Cryo作為一個獨立的組件，性能優(yōu)于使用集成光鏡進行定位的EM解決方案，同時也釋放了寶貴的EM儀器時間。

使用熒光珠在樣本上施加一個基準標記。通過確定它們在三維圖像數(shù)據(jù)中的位置，可以顯著提高Z軸上的定位精度。此外，徠卡還開發(fā)了一種基于插值的方法，能夠以比系統(tǒng)的實際光學分辨率更高的精度找到熒光珠中心（正在申請zhuan li）。

LAS X Coral Cryo：基于插值的三維定位，使用X和Y方向的Z-堆棧的截面。標記可在所有相關窗口中交互移動。

安全完成工作流程的各個階段

STELLARIS 5 Cryo可結合先進的CryoET定位軟件（LAS X Coral Cryo），還可以無縫集成和轉移到低溫FIB或VCT平臺。傳統(tǒng)的低溫電子斷層掃描的工作流程包含多個復雜的步驟，特別容易出錯，并經(jīng)常破壞后續(xù)重要的成像步驟。人工準備、處理和轉移樣本的步驟不僅麻煩、繁瑣，還可能導致樣本污染或反玻璃化。

Coral Cryo的工作流程改變了這一點。通過簡化工作流程，可以實現(xiàn)更廣泛的CryoET應用。精簡的步驟、高靈活性和安全性，可確保樣本的活力、質(zhì)量檢查，實現(xiàn)精確和可靠的三維定位機制。

低溫平臺是一個更穩(wěn)定的封閉系統(tǒng)，更容易操作，且無需從平臺上取下冷卻插件。樣本轉移梭的裝載過程簡單，可將樣本損失的風險降至zui di，并促進沿儀器平臺的轉移。

STELLARIS 5 Cryo可結合先進的冷凍電子斷層掃描定位軟件 (LAS X Coral Cryo)，并與冷凍FIB或VCT階段的各種無縫集成和傳輸選件結合使用。

 Clamydomonas TauSense比例尺10µm

Coral Cryo - 工作原理

集成解決方案的優(yōu)勢

如果沒有準確的目標位置，片狀目標區(qū)域的方法通常是一種耗時的迭代方法。與集成 LM-EM版本相比，使用Coral Cryo工作流程和STELLARIS 5 Cryo共聚焦顯微鏡可以通過共聚焦技術提供更高的分辨率，更好的圖像質(zhì)量和更高的Z分辨率。Coral Cryo為精確檢測目標熒光提供了光譜靈活性，我們du te的TauSense技術

以消除不需要的自發(fā)熒光，并對目標識別進行微調(diào)，在進入EM階段之前可以預先檢查。

用TauSense成像工具檢查硅藻。光譜-500-640 nm光譜帶的強度圖像。TauContrast-Look-up-table表示光子的平均到達時間；短的到達時間為藍色，長的到達時間由黃色過渡到紅色。顯示了不同的結構。TauSeparation-T光譜成分被分離，成分1顯示葉綠體的自發(fā)熒光，0.1 ns；成分2顯示純凈的LifeAct-GFP信號，平均到達時間2.7 ns。樣本由德國TU Dresden，B CUBE的Nicole Poulsen提供。

靈活性

Coral Cryo提供兩種不同的工作流程解決方案，為低溫FIB顯微鏡提供高靈活性。通過我們靈活的工作流程，我們的低溫傳輸系統(tǒng)EMVCT可以連接市場上所有的低溫FIB 解決方案，為您提供Coral Cryo工作流程的所有優(yōu)勢。對于Thermo Scientific Aquilos的用戶，我們提供集成解決方案，通過將我們的樣本盒與Aquilo低溫FIB 的硬件整合，進一步減少工作流程的步驟。

精簡的端到端Coral Cryo工作流程提供了明確的步驟、模塊和無縫的硬件和軟件接口。由于無縫的硬件和軟件接口，Coral Cryo可以快速部署在您的設施或?qū)嶒炇摇?/p>

熒光結構的三維定位用于冷凍電子斷層掃描

熒光結構的三維定位用于冷凍電子斷層掃描。薄片轉移到低溫TEM上。由德國Martinsried的Max-Planck生物化學研究所的Anna Bieber和Cristina Capitanio友情提供；Stem由Florian Wilfling提供。

通過超分辨率的低溫共聚焦顯微鏡識別熒光結構。使用樣本周圍的珠子作為相關標記，可以在低溫FIB-SEM上識別目標結構，并從細胞體積中磨出含有目標結構的薄片。薄片被轉移到低溫TEM上，記錄薄片的傾斜系列。從傾斜系列中可以計算出三維體積，其分辨率可達亞納米級，并為可視化和分析創(chuàng)建一個渲染圖。

· A - 共聚焦三維體積的最大強度投影。目標結構（表達Ede1-eGFP的酵母細胞，參與凝集素介導的內(nèi)吞作用）由一個箭頭描述出來。

· B - FIB研磨后的TEM中的FIB片層，疊加Ede1-eGFP的熒光。

· C - 片層體積斷層圖的示例性圖像。正方形表示圖像D的位置。

· D-斷層圖的細節(jié)，描繪了相分離的內(nèi)細胞蛋白沉積。

比例尺：A - 內(nèi)部網(wǎng)格方塊的寬度。90μm，條寬：35 µm.B, C, D - 插入物的邊緣長度為2微米。

LNG-non-LNGHeLa細胞標記色：深藍色-Hoechst，細胞核；綠色-MitoTracker Green，線粒體；紅色-Bodipy，脂質(zhì)滴。白色-珠子，反射模式-網(wǎng)格條。細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。