徠卡共聚焦課堂第11講：熒光壽命成像與熒光共振能量轉(zhuǎn)移

體內(nèi)生化定量
熒光壽命是熒光團(tuán)在發(fā)射熒光光子返回基態(tài)之前保持其激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間長(zhǎng)度。這取決于熒光團(tuán)的分子組成和納米環(huán)境。
FLIM將壽命測(cè)量與成像相結(jié)合：對(duì)每個(gè)圖像像素以測(cè)得的熒光壽命進(jìn)行顏色編碼，產(chǎn)生額外的圖像反差。因此，F(xiàn)LIM可以提供關(guān)于熒光分子空間分布的信息和有關(guān)其生化狀態(tài)或納米環(huán)境的信息。 FLIM的典型應(yīng)用是FLIM-FRET。FRET是研究分子相互作用的成熟技術(shù)。它能用來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)合并在埃的尺度上估算分子間的距離。
 

 
FRET—原理
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)描述了存儲(chǔ)在激發(fā)的熒光分子（供體）中的能量向其附近的非激發(fā)的熒光分子（受體）的非輻射轉(zhuǎn)移。FRET的發(fā)生必須滿(mǎn)足三個(gè)條件：
供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜的重疊（圖1）
在納米(10^–9 m)級(jí)上分子必須非常接近（圖2–4）
分子必須具有適當(dāng)?shù)南鄬?duì)方位
 
圖1：供體的發(fā)射光譜（此處為ECFP，藍(lán)線）必須與受體的激發(fā)光譜（此處為EYFP，黃線）重疊。這一要求意味著FRET對(duì)中的兩個(gè)分子都具有兼容的能級(jí)。

圖3：在遠(yuǎn)大于閾值R₀（也稱(chēng)為福斯特半徑）的距離r處，無(wú)能量轉(zhuǎn)移。

 
圖4：如果分子緊密接觸，則來(lái)自激發(fā)光子（藍(lán)色箭頭）的能量以非輻射方式轉(zhuǎn)移到受體。后者又發(fā)射光子（黃色箭頭）。該過(guò)程(E)的效率與r^–6密切相關(guān)。
 
影響
由于與r^-6密切相關(guān)（圖4），F(xiàn)RET發(fā)生在與生化反應(yīng)高度相關(guān)的空間尺度上，例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA相互作用。FRET可以通過(guò)靈敏的熒光讀數(shù)來(lái)探測(cè)分子間的相互作用。這能讓研究人員在體外和體內(nèi)研究分子相互作用。通過(guò)合適的熒光標(biāo)記將兩個(gè)相關(guān)的相互作用方連接起來(lái)，可以分析雙分子相互作用。FRET還允許構(gòu)建生物探針，通過(guò)強(qiáng)烈的構(gòu)象變化導(dǎo)致的分子內(nèi)FRET來(lái)報(bào)告第二信使的濃度或離子強(qiáng)度。
FRET無(wú)疑已發(fā)展成為細(xì)胞生物學(xué)、生物物理學(xué)和生物醫(yī)學(xué)成像中廣泛使用的工具。
 
方法理論
有很多技術(shù)可以在顯微鏡環(huán)境中檢測(cè)FRET。常見(jiàn)的的是基于供體（受體光漂白，F(xiàn)RET AB）或受體（敏化發(fā)射，F(xiàn)RET SE）熒光強(qiáng)度的技術(shù)。
使用標(biāo)準(zhǔn)共聚焦顯微鏡可以輕松應(yīng)用基于強(qiáng)度的FRET。但它也存在缺點(diǎn)。FRET AB不能應(yīng)用于時(shí)間序列實(shí)驗(yàn)，并且容易受到供體分子的可逆光漂白或光轉(zhuǎn)換的影響。另一方面，F(xiàn)RET SE受到所有FRET對(duì)固有光譜串?dāng)_的影響，需要仔細(xì)的校準(zhǔn)測(cè)量以及對(duì)所得圖像的線性拆分。本文介紹了一種基于熒光壽命顯微成像 (FLIM) 的FRET測(cè)量方法。
 
熒光壽命
熒光過(guò)程通常被理解為分子中從電子基態(tài)（S₀）到其激發(fā)態(tài)（S₁）的能量躍遷。（圖5，左）。這種躍遷可由具有適當(dāng)能量（即頻率或波長(zhǎng)）的入射光引起。吸收的能量由熒光分子儲(chǔ)存一小段時(shí)間，然后才能作為熒光發(fā)射。分子處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間稱(chēng)為熒光壽命。對(duì)于許多有機(jī)染料和熒光蛋白，熒光壽命通常為幾納秒(10^–9 s)左右。
 
熒光壽命和FRET
從激發(fā)態(tài)弛豫的另一種過(guò)程是FRET。通過(guò)FRET激發(fā)，能量以非輻射方式轉(zhuǎn)移到受體分子。然后受體分子以熒光方式弛豫（圖5，右）。由于供體發(fā)熒光和能量轉(zhuǎn)移是一個(gè)相互競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程，因此在存在FRET的情況下，激發(fā)態(tài)的消耗速率會(huì)增加。有人可能會(huì)說(shuō)，供體分子處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)生FRET的可能性就越大。只能觀察到來(lái)自供體分子且通過(guò)熒光弛豫的光子。轉(zhuǎn)移到受體分子的能量由于受體熒光的波長(zhǎng)較長(zhǎng)而不會(huì)被檢測(cè)到。 因此，F(xiàn)RET縮短了供體熒光壽命（圖6）。

 
圖5：FRET對(duì)中的能量躍遷。與供體分子中的躍遷能匹配的光被吸收（藍(lán)色箭頭）。激發(fā)的供體可以通過(guò)熒光（灰色箭頭，左）或通過(guò)共振能量轉(zhuǎn)移到受體分子（黑色箭頭）而弛豫。

 
圖6：對(duì)激發(fā)后一段時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到的熒光光子數(shù)作圖。激發(fā)脈沖后發(fā)射光子的初始數(shù)量a₀呈指數(shù)衰減。熒光衰減到a₀/e (~ 37%)所需的時(shí)間為熒光壽命。由于存在FRET (τ-quench)，壽命τ變?yōu)楦痰臅r(shí)間。壽命衰減的另一個(gè)讀數(shù)是振幅a₀。測(cè)量掃描系統(tǒng)中每個(gè)位置的壽命會(huì)產(chǎn)生壽命的空間圖（見(jiàn)插圖）。
 
熒光壽命成像 (FLIM)
Leica SP8 FALCON使用脈沖激光和單光子計(jì)數(shù)檢測(cè)器在時(shí)域中測(cè)量熒光壽命。通過(guò)建立檢測(cè)到的熒光事件的直方圖來(lái)確定壽命?？娠@示單指數(shù)或多指數(shù)熒光衰減。數(shù)值曲線擬合表示熒光壽命和振幅（即檢測(cè)到的光子數(shù)）。
由于FRET減少了供體壽命，因此如果無(wú)FRET的供體壽命已知，就可以量化FRET發(fā)生的程度。該供體壽命τ作為分析FRET樣品的絕對(duì)參考。因此，F(xiàn)LIM-FRET為內(nèi)部參照—這一特點(diǎn)減少了基于強(qiáng)度測(cè)量FRET時(shí)的很多缺點(diǎn)。由于其熒光壽命是染料的固有特性，因此對(duì)其他不利影響（如光漂白、圖像明暗處理、不同濃度或表達(dá)水平）具有廣泛的不變性。
使用基于強(qiáng)度的FRET測(cè)量的主要限制是所有可觀察的供體分子都經(jīng)歷FRET的基本假設(shè)。通常情況并非如此。供體分子這種變化的“非結(jié)合"組分給測(cè)量的FRET效率帶來(lái)了相當(dāng)大的不確定性，使得無(wú)法在實(shí)驗(yàn)之間進(jìn)行比較。FLIM-FRET克服了這一缺點(diǎn)。
 
使用活細(xì)胞記錄FLIM圖像
如前所述，F(xiàn)RET效率根據(jù)發(fā)生FRET供體的壽命τ_quench與未發(fā)生FRET的壽命τ的比率計(jì)算得出：

 
為此，τ必須從僅包含供體的樣品進(jìn)行的測(cè)量來(lái)獲得。必須排除來(lái)自受體的任何發(fā)射光。外部檢測(cè)器通常使用帶通濾色片。而內(nèi)部探測(cè)器可調(diào)節(jié)檢測(cè)范圍為只記錄供體發(fā)射光。測(cè)量?jī)H供體樣品和FRET樣品時(shí)必須使用相同的設(shè)置。
 
活細(xì)胞中的CFP-YFP FRET
在該工作中，我們使用由CFP-YFP融合蛋白組成的FRET構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)RBKB78細(xì)胞（圖7）。兩個(gè)熒光蛋白由兩個(gè)氨基酸的短連接物連接[1]。這種供體-受體融合也可以作為真實(shí)場(chǎng)景中FRET的良好陽(yáng)性對(duì)照。“僅供體"樣品由僅用CFP轉(zhuǎn)染的相同細(xì)胞組成（圖7A）。僅供體和FRET樣品（圖7B）的平均壽命可在快速FLIM模式下計(jì)算出近似值。壽命分布直方圖表明供體的平均壽命τ為2.1 ns（圖8）。FRET結(jié)構(gòu)的供體壽命為1.4 ns。于是測(cè)得FRET效率E = 1 – (1.4/2.1) = 33%。

 
頂行：圖7：僅用CFP供體（A）和CFP-YFP融合（B）轉(zhuǎn)染的RBKB78細(xì)胞。使用光譜型FLIM檢測(cè)器將檢測(cè)范圍設(shè)置在445-495 nm之間。對(duì)彩色區(qū)域進(jìn)行分析，顏色代表強(qiáng)度調(diào)制的熒光壽命。由德國(guó)維爾茨堡大學(xué)Gregory Harms教授提供。感謝Benedikt Kr?mer博士（Picoquant，柏林）、Jan-Hendrik Spille和Wiebke Buck對(duì)本實(shí)驗(yàn)的支持。
底行：圖8：按平均壽命統(tǒng)計(jì)樣品中僅供體（黃色）和發(fā)生FRET（綠色）的信號(hào)的熒光壽命分布。在FRET樣品中，壽命明顯變短0.7 ns。
 
FRET與無(wú)FRET的比率
大家都知道的，CFP本身至少有兩個(gè)壽命組分[2，3]。此外，我們不知道研究中的所有分子是否都經(jīng)歷FRET。為了公正處理這種復(fù)雜性，人們需要了解平均壽命以外的信息。我們可以進(jìn)行雙組分?jǐn)M合，以此得到兩個(gè)壽命和兩個(gè)振幅。后者能使我們估算一個(gè)壽命與另一個(gè)壽命的相對(duì)比例。尤其是使用振幅可以估算表現(xiàn)出FRET的組分（結(jié)合組分）和不表現(xiàn)出FRET的組分（游離組分）的相對(duì)比例。含有較少第二個(gè)組分的熒光蛋白，例如EGFP或Sapphire，是此類(lèi)分析的理想選擇。

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