徠卡共聚焦課堂第三講：光路篇

 
共聚焦顯微鏡是指一類可以記錄光學(xué)切片的特殊光學(xué)顯微鏡。
通過照亮和觀察單個衍射極限點，在激光共焦系統(tǒng)中實現(xiàn)光學(xué)切片。這需要兩個光束段焦點一致，因此是“共焦的"。與寬場圖像相反，共聚焦圖像沒有散焦模糊情況。這本身就是一個優(yōu)勢，因為樣品深層的圖像顯示清晰，細(xì)節(jié)豐富。然而，最重要的優(yōu)勢是其具有微觀特征的三維可視化潛力。沿三維（z-stack）采集圖像序列后，由計算機(jī)重建和顯示三維物體。
共焦照明
，通過將光源聚焦在小孔徑（針孔）上，然后聚焦到樣品中，實現(xiàn)點光源照明。當(dāng)孔徑足夠小時，照明點僅受衍射限制，不受光源和孔徑幾何參數(shù)的限制。普通光源是大的面光源，是不可能將其聚焦到衍射極限的光點上。因此，盡管透過率非常低，這種聚焦照明光仍然是十分必要的（對于傳統(tǒng)光源）。

 
圖1：用于共焦成像的照明。來自光源（Ls）的光聚焦于照明針孔（Pi），然后進(jìn)入樣品S。
 
激光作為光源具有非常高的準(zhǔn)直度（良好激光中的光“極度平行"）。因此，在不應(yīng)用針孔的情況下，激光可以通過單個透鏡聚焦到衍射限制的光點上。因此，大多數(shù)共聚焦顯微鏡沒有照明針孔。光點的質(zhì)量取決于激光的光束質(zhì)量。如果質(zhì)量不佳，也可以插入照明針孔。激光通常通過光纖耦合到共聚焦顯微鏡上。這些光纖本身也起針孔的作用。
激光的可聚焦性和高能量密度使其成為共聚焦顯微鏡的理想光源。激光的相干性不是共焦性能所需的特征。相反，這對光學(xué)設(shè)計師來說是一個挑戰(zhàn)，因為它會引起假的干擾圖案，因而需要謹(jǐn)慎的設(shè)計策略。
此外，傳統(tǒng)激光器僅發(fā)射單一顏色（激光-“線"），這一事實本身也有局限，在多熒光成像和測量時，就需要復(fù)雜的多激光排列。白激光很巧妙地解決了多色成像的問題。

 
圖2：共焦（右側(cè)區(qū)域）和非共焦成像的比較。在Feulgen染色的小鼠滋養(yǎng)層中。非共焦圖像的很多信息并非來自焦平面。共焦光學(xué)消除了所有模糊的因素，使結(jié)構(gòu)變得清晰。
 
共聚焦檢測
大多數(shù)探測器具有相當(dāng)大的敏感區(qū)域（光電倍增管通常為幾平方厘米）。共焦光學(xué)器件需要點狀感測。因此，必須通過在光束中插入一個小孔徑（針孔）來執(zhí)行光點檢測。將樣品的光聚焦到該針孔上，收集并記錄透射光。
由于衍射圖取決于數(shù)值孔徑和波長，所以必須進(jìn)行針孔檢測。因此當(dāng)這些參數(shù)改變時，必須調(diào)整針孔尺寸。
當(dāng)物鏡改變時（通常隨數(shù)值孔徑改變而改變），現(xiàn)代的共焦掃描顯微鏡會自動適當(dāng)?shù)馗淖冡樋字睆健Ｒ虼?，針孔通常設(shè)計為雙層或多層光圈。
實際上，針孔的合適尺寸不僅取決于波長和數(shù)值孔徑，還取決于顯微鏡中光學(xué)元件的內(nèi)部放大倍數(shù)。
因此，在設(shè)計不同的顯微鏡中直接比較針孔直徑不僅不可取，也是錯誤的。如果針孔直徑未設(shè)置為最佳值，系統(tǒng)將無法順利進(jìn)行光學(xué)切片（即傳輸散焦模糊），或者在沒有獲得進(jìn)一步的光學(xué)切片質(zhì)量的情況下不必要地切斷強度（導(dǎo)致不必要的噪聲圖像）。

 
圖3：共聚焦成像中的檢測。來自樣品S的光聚焦于觀察針孔（Po），隨后聚焦到檢測器De上。
 
共焦掃描的光路
共焦掃描系統(tǒng)中的共聚焦光束路徑只是點光源照明和點探測的結(jié)合。這種組合可作為光學(xué)刀使用。只有來自焦平面的光子才能傳遞到傳感器。而來自其他地方的所有光子都被濾除。通過“空間濾波器"的方式實現(xiàn)光學(xué)切片。
由于在給定時間內(nèi)，只有一個光點出現(xiàn)“共聚焦"成像，因此需要一個掃描設(shè)備以柵格模式在物場上移動該光點。通常情況下，光學(xué)鏡安裝在掃描電機(jī)上，用于執(zhí)行掃描程序。在掃描全幀（通常）1,024行所需的時間方面遇到了瓶頸。通過引入每秒掃描8,000或更多行的高速掃描儀（共振掃描儀），實現(xiàn)了改進(jìn)。
只有在反射光顯微技術(shù)下才能實現(xiàn)良好的光學(xué)切片。這是近20年熒光顯微技術(shù)蓬勃發(fā)展的原因之一（其他原因還包括免疫染色、DNA-雜交、熒光生物傳感器、量子點和熒光蛋白的發(fā)明）。

 
圖4：從左至右：1. 照明錐不僅在焦平面內(nèi)激發(fā)熒光染料，在其上下都會激發(fā)。此處用綠色雙錐體表示。2. 發(fā)射針孔有效地截斷從焦平面上方發(fā)出的光。3. 此外，來自焦平面下方的光也不會通過針孔。4. 在共聚焦系統(tǒng)中，只有來自樣品的光才會到達(dá)檢測器。檢測針孔會有效拒絕來自其他區(qū)域的任何光。最終得到真正的光學(xué)切面。

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