徠卡共聚焦課堂第二講：激發(fā)篇

 
從濾光片轉(zhuǎn)輪到聲光可調(diào)濾光器（AOTF）
熒光的激發(fā)需要特定顏色的光：既要有效地激發(fā)探針（波長接近探針激發(fā)光譜的最大值），又要留下足夠的空間收集發(fā)射光而不會進入檢測器的光路中。在共聚焦顯微鏡中，通常使用多譜線激光器或激光電池作為激發(fā)光源，這需要設備既能夠自由選擇適合當前實驗所用熒光團的激發(fā)譜線又能夠控制該激發(fā)譜線的強度因為直接在光源處控制強度時，大多數(shù)激光器會出現(xiàn)噪音增強的現(xiàn)象。AOTF（聲光可調(diào)濾光器）的引入簡化了濾光過程，同時顯著提高了實驗的靈活性。AOTF對于耦合白激光源是明智選擇。
濾光片轉(zhuǎn)輪-早期的濾光工具
共聚焦顯微鏡中熒光的激發(fā)光源是激光或不同顏色的激光組合。出于技術原因共聚焦選擇激光作為光源[2]。但是傳統(tǒng)激光器通常只發(fā)射一條或幾條單一波長的激光譜線（現(xiàn)代化解決方案是白光激光器[3]）。然而，生物醫(yī)學成像所使用的熒光染料的激發(fā)光譜從近紫外到近紅外的都有。大多數(shù)情況下，為了同時檢測幾種不同熒光染料的發(fā)射情況，需要通過二向色鏡結合一系列激光譜線來實現(xiàn)。在這種情況下，與在熒光照明中分離激發(fā)和發(fā)射光的“分光鏡"相比，反射鏡以反向模式使用。
由于通常激光器的低頻噪聲頻帶相對較窄，因此不建議直接通過激光功率控制強度。因此，需要一種設備來單獨減弱激光強度。同樣，如果關閉和打開光源次數(shù)過多，激光器壽命也會縮短。特別是氣體激光器，在關閉后仍處于高溫狀態(tài)而未冷卻時，不適合馬上再次開啟。
“激光電池"滿足以上所有要求，它由一系列激光器（通常為3-5個）組成。所有激光器均配有光閘，光閘由機電驅(qū)動并由軟件控制。所有激光器都需要一個用于減弱強度的伺服控制設備（一個帶有一系列灰度濾片濾光片轉(zhuǎn)輪或滑塊）多譜線激光器還需要另一個濾光片轉(zhuǎn)輪或滑塊，它包含一系列邊緣濾片和帶通濾片，以便選擇單譜線或組合譜線。
顯然，整個設置可能會變得略微復雜低效，容易出現(xiàn)錯位和漂移問題，可能在濾片選擇切換過程中引發(fā)機械振動。若改變激發(fā)方案，成像的效率將非常低下，由于安裝在濾光輪或滑塊上的濾光片數(shù)量有限，該設備靈活度不高。

 
圖1：傳統(tǒng)的“激光電池"帶有5個激光管、5個機械光閘、8個光束組合鏡、5個衰減濾光片轉(zhuǎn)輪和1個用于多參數(shù)共聚焦顯微鏡的選擇激發(fā)譜線濾光片轉(zhuǎn)輪。
聲光可調(diào)濾光器-運行方式
簡化機械設置并將靈活性提高幾個數(shù)量級的一個重要步驟是采用聲光可調(diào)濾光器（AOTF）。AOTF是一種可以控制所需顏色的光指向一個不同的方向的設備，而其余顏色的光直接通過 AOTF [1]。AOTF由晶體制成，通常是TeO₂或SiO₂或其他具有類似特性的化合物。晶體由機械轉(zhuǎn)換器在幾百兆赫范圍內(nèi)的機械波激發(fā)（聲光可調(diào)濾光器的“聲"是指機械波，盡管頻率不符合人耳可聽見聲音的頻率）。最重要的是所需光束偏轉(zhuǎn)的方向是固定的，不會隨光的顏色而改變。此外，方向的進光量也可以通過機械波的振幅進行控制。
激光電池發(fā)射出不同波長的激光譜線（準直）后，AOTF可以選擇任意波長的譜線使之偏轉(zhuǎn)至所需方向，并可控制該譜線的能量。AOTF可以真正同時選擇多條譜線，譜線數(shù)量主要取決于采購設備具體情況。一個好的系統(tǒng)可同時提供8條譜線。
總而言之，AOTF用機械固定的單晶*取代了上述所有快門、衰減濾片和譜線選擇濾片，可以輕松實現(xiàn)任意譜線的組合；當激光電池同時提供8條譜線時，組合方式達到256種——這對于AOTF來說不是問題。另外：每條選定的譜線在強度上都是無級可控的。本質(zhì)上，AOTF是一個“8-通道激光調(diào)光器"。
工程師可能會認為，AOTF將兩種偏振模式導向不同的方向。這是*正確的，并不損害概念。無論如何，激光都是偏振光，因此光將始終指向既定方向。垂直方向無激光，沒有任何指向。

 
圖2：在以傳統(tǒng)激光電池為光源的共聚焦照明中，AOTF（右邊的方框）替換了所有快門、衰減濾片和譜線選擇濾片，任何進入AOTF的譜線都可以得到抑制、衰減或*用于共聚焦顯微鏡。由激光器發(fā)射的任意譜線都可進行組合（組合數(shù)量大但有限）。
 
AOTF-額外的好處

 
圖3：用不同激光譜線或不同強度的同一條激光譜線掃描感興趣的區(qū)域。在激光譜線掃描期間，照明方式會根據(jù)預定義的模式在預設點發(fā)生變化。任何組合都是可能的，幾乎所有圖形都可以使用鼠標在預掃描的圖像上繪制。當然，也可應用幾何圖案（矩形、圓形、橢圓形……）?！傲憔€"也是一種模式，常用于保護細胞培養(yǎng)物中的背景細胞。
 
聲光分束器可在特定樣本中進行任一符合熒光染料組成的激光組合。除此以外，假設用兩種不同的熒光染料對標本進行染色，一種非常強，另一種非常弱，而無級調(diào)諧通過調(diào)暗明亮染料的激發(fā)來檢測強度相似的兩種熒光，可以平衡熒光發(fā)射強度。因為AOTF的控制速度很快，不需要停止掃描過程，所以很容易在成像過程中即時實現(xiàn)， 
通過無級控制來平衡激發(fā)光強度，不僅有利于對比熒光通道，而且還是改善熒光染料光譜拆分的利器。許多染料的發(fā)射光譜出現(xiàn)“拖尾"現(xiàn)象，導致在成像的通道收集了錯誤的信號。通過將激發(fā)降低，可以改善發(fā)射光譜的拆分（抑制串色）。
 
最后，選定譜線的波長（和強度）之間的切換在幾微秒內(nèi)完成，速度非?？?；相比之下，機械標準濾光片轉(zhuǎn)輪大約需要一秒鐘。這種快速切換使得在單條譜線的掃描期間可以改變激發(fā)方式（采用何種波長的譜線，這些譜線分別對應多大強度）。此功能可在樣本上繪制用不同激發(fā)光激發(fā)的區(qū)域，即所謂的“感興趣區(qū)域"，在這些區(qū)域中，不同的激光被激活用于成像。此外，無需采集信號的區(qū)域不會被照射，非常好地保護了樣本以供日后研究。本文開頭的圖片展示了這類感興趣區(qū)域，在單次掃描中應用了5種不同的參數(shù)設置。
最后，如果選擇白光激光器作為光源，AOTF可以選擇白激光中任何可用的顏色。在此情況下，聲光可調(diào)濾光器將白激光光源變成可調(diào)光源。

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